Cell Proliferation Assay II

Cell Proliferation Assay II
DNA measurement

          การวัดอัตราการเพิ่มจำนวนของเซลล์มีอยู่หลากหลายวิธีด้วยกัน วิธีที่นิยมอย่างแพร่หลายคือวัดจากกระบวนการเมตาบอลิซึมภายในเซลล์ ยกตัวอย่างเช่น MTT assay หรือ AlarmaBlue® assay อย่างไรก็ตามในกรณีที่สารทดสอบมีผลรบกวนต่อกระบวนการเมตาบอลิซึมทำให้ผลการทดลองที่ได้รับนั้นไม่ถูกต้อง ผู้วิจัยจำเป็นต้องเปลี่ยนวิธีในการตรวจสอบปริมาณการเพิ่มจำนวนของเซลล์นั้นคือ การวัดปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้นภายในเซลล์ ซึ่งเป็นวิธีการตรวจสอบการเพิ่มจำนวนของเซลล์ได้โดยตรงและถูกต้องมากที่สุด
          เทคนิคที่ใช้ในการวัดปริมาณดีเอ็นเอมีอยู่หลายวิธีเช่นกันยกตัวอย่างเช่น การใช้สีฟลูออเรสเซ็นต์ (CyQUANT® assay) การใช้เทคนิค BrdU หรือ EdU cell proliferation assay และวิธีอื่น ๆ
          CyQUANT® assay ใช้หลักการของสี Green fluorescent CyQUANT GR dye เมื่อจับกับสายของดีเอ็นเอจะทำให้เกิดการเรืองแสงขึ้น ปริมาณของความเข้มของสี fluorescence ที่เกิดขึ้นเท่ากับปริมาณของเซลล์ที่เพิ่มจำนวนขึ้นเช่นกัน เทคนิคนี้ผู้วิจัยจำเป็นต้องดูดอาหารเลี้ยงเซลล์ออกแล้วทำการ แช่แข็งเซลล์ หลังจากนั้นจะมีการเติม lysis buffer ที่ผสม CyQUANT dye ไว้แล้ว แล้วทำการอ่านค่าความเข้มของสี fluorescence ที่เกิดขึ้น (รูปที่ 1) ในหนึ่งชุดของ CyQUANT® GR dye จะประกอบไปด้วย CyQUANT® GR dye reagent, Cell-lysis buffer, DNA standard สำหรับ calibration, และ insert protocol


 รูปที่ 1. แสดงขั้นตอนการวัดปริมาณเซลล์ด้วยชุดตรวจสอบ CyQUANT® GR dye

          นอกจากนี้ยังมี CyQUANT® NF (catalog number และ CyQUANT® Direct cell proliferation kit ซึ่งทั้งสองชุดดังกล่าวนั้นมีความสะดวกในขั้นตอนของการทำมากกว่า CyQUANT® GR dye เนื่องจากสี fluorescence ที่ใช้ มีคุณสมบัติเป็น cell-permeability ซึ่งสามารถผ่านเข้าสู่เซลล์ได้โดยไม่ต้องมีการใช้ cell-lysis buffer (รูปที่ 2) ดังนั้นขั้นตอนในการ ล้าง แช่แข็ง รวมถึงการย่อยเซลล์จึงถูกตัดออกไป ทำให้ผู้วิจัยมีความสะดวกรวดเร็วในการใช้มากขึ้น


รูปที่ 2. แสดงขั้นตอนการวัดปริมาณเซลล์ด้วยชุดตรวจสอบ CyQUANT® NF และ Direct cell proliferation assay kit

BrdU assay 
          5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) เป็น derivative ของ dUTP  โดยหลักการBrdU จะจับกับสารดีเอ็นเอที่ถูกสังเคราะห์ขึ้นภายในเซลล์ จากนั้นจะทำการติดตามปริมาณของ BrdU ด้วย anti-BrdU antibody ที่ติดกับสี fluorescence แล้วทำการวิเคราะห์ หรือตรวจสอบด้วยเครื่อง flow cytometer และ fluorescence imaging microscopy ตามลำดับ แต่อย่างไรก็ตามการใช้  BrdU ในการตรวจสอบนั้นค่อนข้างมีความยุ่งยาก ต้องใช้คนที่มีความชำนาญ รวมถึงใช้เวลา แรงงาน และสารเคมีมากในการด้วยวิธีนี้ ปัจจุบันจึงมีการพัฒนาวิธีที่สะดวกรวดเร็ว และให้ผลการทดลองที่ดีกว่า นั้นคือ Click-iT® Edu cell proliferation assay kit (catalog number C35002)
          Click labeling reaction ใช้หลักการทางเคมีโดยมี copper เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาระหว่างหมู่ Azide และ Alkyne เกิดเป็นพันธะ Triazole ซึ่งเป็น covalent bond ที่มีความแข็งแรงมาก (รูปที่ 3) ดังนั้นจึงได้มีการนำเทคนิค Click มาพัฒนาและประยุกต์ใช้ในการวิเคราะห์หาปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขี้นในกระบวนการ cell proliferation โดยใช้หลักการคล้ายกับ BrdU แต่เปลี่ยนเป็น EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) ซึ่งเป็น derivative ของ dUTP เช่นกัน แต่ EdU จะมีการเติมพันธะ Alkyne เข้าไปเพื่อให้สามารถตรวจสอบได้ด้วยสี fluorescence ที่มีพันธะ Azide เมื่อผ่านปฏิกิริยา Click-iT ด้วยตัวเร่ง copper จะทำให้ EdU ติดกับสี fluorescence ได้ด้วยพันธะ Triazole


รูปที่ 3. แสดงการเกิดปฏิกริยา Click-iT ระหว่างพันธะ Alkyne และ Azide ด้วยตัวเร่งปฏิกริยา copper
ทำให้เกิด covalent bond นั้นคือ Triazole

ข้อดีของ Click-it EdU เมื่อเทียบกับ BrdU คือ 
          1. ความสามารถในการผ่านเข้าสู่เซลล์ของ EdU นั้นง่ายกว่าการใช้  BrdU ด้วยเหตุผลของขนาดโมเลกุล 

          2. การใช้แอนติบอดีซึ่งเป็นชีวโมเลกุลขนาดใหญ่ทำให้ต้องมีขั้นตอนนของการ permeabilize cell ด้วยวิธีที่รุนแรง และใช้ระยะเวลานาน ขณะที่ EdU assay จะถูกตัดขั้นตอนดังกล่าวออกไป ทำให้ระยะเวลาในการทำสั้นลงมากเมื่อเทียบกับ BrdU assay 
          3. EdU assay นั้นใช้หลักการของการจับระหว่างหมู่ alkyne และ azide ซึ่งเกิดเป็น covalent bond ที่มีความแข็งแรง ขณะที่ ขณะที่ BrdU assay นั้นจะต้องใช้ antibody ในการจับกับ BrdU ด้วย non-covalent bond ซึ่งเป็นพันธะที่อ่อน นอกจากนี้การใช้แอนติบอดีอาจจะทำให้เกิด non-specific binding กับชีวโมเลกุลอื่น ๆ ภายในเซลล์ได้ ขณะที่การเกิดพันธะระหว่าง alkyne และ azide จะเกิดขึ้นได้ยากภายในเซลล์จึงมีโอกาสน้อยมากที่จะเกิด non-specific binding ใน EdU assay


รูปที่ 4. แสดงภาพเปรียบเทียบระหว่างวิธี Click-iT® EdU cell proliferation assay (ซ้าย) และ BrdU cell proliferation assay (ขวา)

Related product :

Catalog number 

Product name

Unit size

A10034 

   Click-iT® EdU Pacific Blue™ Flow Cytometry Assay Kit 

50 assays

A10044

   EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)

50 mg

A10202

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 647 Flow Cytometry Assay Kit 

1 kit

A20012

   Alexa Fluor® 555 azide, triethylammonium salt

0.5 mg

A20013

   Alexa Fluor® 555 alkyne, triethylammonium salt

0.5 mg

C10214

   Click-iT® EdU Microplate Assay 

1 kit

C10337

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit (REPLACES EdU product C10083) 

1 kit

C10338

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 555 Imaging Kit 

1 kit

C10339

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 594 Imaging Kit (REPLACES EdU Product C10084) 

1 kit

C10340

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 647 Imaging Kit (REPLACES EdU Product C10085) 

1 kit

C10350

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 488 HCS Assay (REPLACES EdU Product A10027) 

1 kit

C10351

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 488 HCS Assay (REPLACES EdU Product A10028) 

1 kit

C10352

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 555 HCS Assay *2-plate size*

1 kit

C10353

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 555 HCS Assay *10-plate size* 

1 kit

C10354

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 594 HCS Assay (REPLACES A10208) 

1 kit

C10355

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 594 HCS Assay (REPLACES EdU Product C10081) 

1 kit

C10356

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 647 HCS Assay (REPLACES EdU Product A10208) 

1 kit

C10357

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 647 HCS Assay (REPLACES EdU Product C10082)

1 kit

C35002

   Click-iT® EdU Alexa Fluor® 488 Flow Cytometry Assay Kit 

1 kit

C35006

   CyQUANT® NF Cell Proliferation Assay Kit *1000 assays* 

1 kit

C35007

   CyQUANT® NF Cell Proliferation Assay Kit *200 assays* 

1 kit

C7026

   CyQUANT® Cell Proliferation Assay Kit - for cells in culture - 1000 assays

1 kit

C7027

   CyQUANT® cell lysis buffer - 20X concentrate

1 kit

E10187

   EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)

500 mg

E10415 

   EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)

5 g

                                                                                                           
More information :  www.invitrogen.com/clickit
Contact to Technical Support Gibthai, Email :
tas@3nholding.com

 

ContactGibthai
Copyrights © 2015 & Gibthai Co., Ltd. All Rights Reserved
Privacy Policy |   Terms of Service